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RECONGELACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES BOVINOS COMO
ALTERNATIVA PARA MEJORAR LA
CALIDAD ESPERMÁTICA DEL SEMEN
REFROZEN OF BOVINE SPERM AS AN ALTERNATIVE TO IMPROVE
THE SPERM QUALITY OF SEMEN
Recibido: 13/08/2021- Aceptado: 13/06/2022
CARLOS ANDRÉS MANCHENO HERRERA
Docente de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo
Riobamba - Ecuador
Magíster en Reproducción Animal
Mención en Reproducción Bobina
Escuela Superior Politécnica de Chimborazo
andres.mancheno@espoch.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-2682-0336
PABLO RIGOBERTO ANDINO NÁJERA
Docente de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo
Riobamba - Ecuador
Magíster en Reproducción Animal
Escuela Superior Politécnica de Chimborazo
pablo.andino@espoch.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-0515-5330
Cómo citar este artículo:
Mancheno, A. & Andino, P. & Villafuerte, (Julio - diciembre de 2022).
Recongelación de espermatozoides bovinos como alternativa para
mejorar la calidad espermática del semen. Sathiri (17),2 103-117.
https://doi.org/10.32645/13906925.1133
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Cómo citar este artículo:
Mancheno, A,. Duchi, N,. Andino. P. & Villafuerte, A. (Julio - diciembre de 2022). Recongelación de espermatozoides bovinos como alternativa para mejorar
la calidad espermática del semen. Sathiri (17),2 103-117. https://doi.org/10.32645/13906925.1133
Resumen
El objetivo fue evaluar el efecto de la recongelación de espermatozoides bovinos sobre la calidad
espermática de semen descongelado. Para esto se realizó la descongelación del semen en agua a
56 oC durante 12 segundos para simular una agresión seminal máxima, el contenido de las pajillas
se vertió en tubos de ensayo para mantenerlos atemperados a 37 oC e incubarlos con 5 ml del
medio Tyrode durante 15 minutos. Transcurrido este tiempo se realizó el análisis microscópico
del semen, se realizaron dos centrifugaciones 300 rpm/5minutos - 800 rpm/10 minutos y se
determinó la concentración espermática con la ayuda de un contador digital de células para
diluir el semen; la estabilización y acondicionamiento de los espermatozoides se la realizó a
temperatura ambiente (14 – 20 oC) durante 45 minutos y bajo luz ultravioleta, posteriormente
se procedió al envasado y sellado de las pajillas usando pajillas de 0.5 ml y alcohol polivinílico
para sellarlas. Se realizaron las curvas de temperatura y nalmente la recongelación en vapores
de nitrógeno. Para la comprobación de hipótesis se utilizaron las técnicas de análisis de ADEVA
(Análisis de Varianza) y separación de medidas por el método del rango múltiple de Waller Duncan
a un nivel de signicancia p<0,01. Se determinó así, que en los parámetros evaluados el semen
recongelado mostró mejores resultados como en el daño de ADN en donde se determinó que el
semen recongelado presentó un menor daño con un 1,07 % a diferencia del semen congelado
el cual presentó un 8,74% de daño. Al analizar las diferentes variables de semen recongelado
se determinó que el efecto de esta biotecnología es positivo en variables como el daño en el
ADN y daño en la membrana espermática, teniendo valores inferiores a los reportados en
semen congelado; lo que indica que al recongelar espermatozoides la calidad espermática
mejora especialmente en las variables mencionadas. Se recomienda utilizar espermatozoides
recongelados en biotecnologías reproductivas como la Fertilización In Vitro.
Palabras clave: recongelación, espermatozoides, bovinos, calidad seminal, semen.
Abstract
The objective was to evaluate the eect of re-freezing bovine sperm on the sperm quality of
thawed semen. For this, the semen was thawed in water at 56 oC for 12 seconds to simulate a
maximum seminal aggression, the contents of the straws were poured into test tubes to keep
them tempered at 37 oC and incubated with 5 ml of Tyrode medium for 15 minutes. After this
time, the microscopic analysis of the semen was carried out, two centrifugations were carried out
300 rpm / 5 minutes - 800 rpm / 10 minutes and the sperm concentration was determined with the
help of a digital cell counter to dilute the semen; The stabilization and conditioning of the sperm
was carried out at room temperature (14-20 oC) for 45 minutes and under ultraviolet light, then
the straws were packed and sealed using 0.5 ml straws and polyvinyl alcohol to seal them. The
temperature curves and nally the refreezing in nitrogen vapors were carried out. For hypothesis
testing, the analysis techniques of ADEVA (Analysis of Variance) and separation of measurements
by the Waller Duncan multiple range method were used at a signicance level of p <0.01. It
was thus determined that in the parameters evaluated the reconfrozen semen showed better
results as in the DNA damage where it was determined that the reconfrozen semen presented
less damage with 1.07% in contrast to the frozen semen which presented 8, 74% damage. When
analyzing the dierent variables of re-frozen semen, it was determined that the eect of this
biotechnology is positive in variables such as DNA damage and sperm membrane damage, having
values lower than those reported in frozen semen; which indicates that when sperm is re-frozen,
sperm quality improves especially in the mentioned variables. It is recommended to use re-frozen
sperm in reproductive biotechnologies such as In Vitro Fertilization.
Key words: refrozen, sperm, bovine, seminal quality, semen.
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RECONGELACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
Introducción
Almela (2014) se convierte en la primera investigadora en reportar datos acerca de la
recongelación de espermatozoides bovinos con la nalidad de conservar gametos masculinos
de la raza Murciano Levantina, en peligro de extinción. En sus resultados reporta datos
interesantes y menciona que en cuanto a la calidad seminal se presentan mejores valores en
semen descongelado de una congelación normal que en el recongelado haciendo hincapié en
que existieron diferencias muy marcadas entre los animales sujetos al estudio. Sin embargo,
al realizar un estudio de fertilidad con el semen recongelado inseminando a 7 novillas frisonas
reporta un 57,1% de fertilidad, lo que se traduce en que se puede usar esta técnica para la
conservación In vitro.
Por otro lado, Carwel et al. (2010, págs. 140-141), en su trabajo realizado acerca de la
recongelación de semen de cabras, mencionan que la recongelación brinda la oportunidad
de volver a congelar semen que se ha descongelado por error. Otra especie en la que se ha
trabajado en esta biotecnología es la equina con la nalidad de aprovechar el material genético
en técnicas de reproducción animal asistida como la ICSI en donde el semen ha sido sometido
hasta 8 recongelaciones y se ha demostrado que el ADN comienza a desnaturalizarse a partir
de la quinta recongelación (Chelsey, Pinto, Cramer, Love, & Paccamonti, 2017, págs. 19-24).
Otro experimento realizado en semen bovino demostró que el semen descongelado
presentó mejores características al ser enfriado en hielo seco a -79o C antes de ser recongelado
en nitrógeno líquido a -196o C mejorando las tasas de motilidad en un 13 a 17% (Abdussamand,
Gauly, & Holtz, 2015, págs. 278-284).
A estos trabajos se suman, además, investigaciones realizadas en semen humano con
la nalidad de mediar las criolesiones de los espermatozoides sometiéndolos a varios ciclos
de congelación y recongelación, las muestras provinieron de hombres con cáncer testicular y
hombres sanos en donde se demostró que los espermatozoides de hombres sanos resisten
dos ciclos más que los espermatozoides de hombres con la patología mencionada (Verza, Feijo,
& Esteves, 2009, págs. 581-590).
Ante esto se planteó la hipótesis de que la selección de los mejores espermatozoides y su
recongelación ayudarán a mejorar sus propiedades en variables como la membrana plasmática
y cromatina (paquete de ADN), incrementando así su capacidad fecundante al ser utilizados en
biotecnologías como la fertilización In vitro.
Además, se vio la necesidad de investigar la inuencia de esta biotecnología en la
calidad seminal para solucionar problemas de desperdicio de material genético que es valioso
e irrecuperable al brindar la oportunidad de utilizar una parte de éste y volver a crioconservarlo
para futuros estudios y pruebas a nivel de laboratorio.
Materiales y métodos
El trabajo de campo de la presente investigación se realizó en la parroquia Nuevo Mundo
perteneciente al cantón Riobamba, provincia de Chimborazo.
El trabajo de laboratorio se realizó en el Laboratorio de Reproducción Animal de la
Escuela Superior Politécnica de Chimborazo ubicado en la Panamericana sur Km 1 ½.
Los materiales utilizados para la investigación fueron los siguientes:
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Material de campo:
►►Registros de campo
►►Overol
►►Botas de caucho
►►Sogas
►►Vagina articial marca Minitube
►►Camisa de Vagina Articial
►►Cono de vagina articial
►►Tubos Falcon de 15 cc
►►Papel aluminio
►►Guantes de nitrilo
►►Guantes de inseminación articial
►►Cinta métrica
►►Tijeras
►►Mascarilla
►►Termo de 1 litro
►►Termómetro de mercurio
Materiales de laboratorio:
►►Microscopio óptico Marca Boeco con lentes objetivos de 4X, 10X, 40X y 100X
►►Placas porta y cubre objetos
►►Platina calefactora para microscopio
►►Contador digital de células Marca Luna con opción de uorescencia
►►pH metro digital Marca PCE
►►Micropipetas de 0.5 a 10 µL, de 10 a 100 µL y de 100 a 1000 µL Marca Oxford
►►Puntas de Micropipetas
►►Tubos de Eppendorf
►►Baño maría de 7 litros marca Mermmert
►►Termo descongelador de semen automático Marca Cito Test
►►Centrífuga Marca Boeco
►►Diluyente de semen con Lecitina de Soya
►►Agua bidestilada
►►Colorante eosina – nigrosina
►►Guantes de nitrilo
►►Pinzas
►►Tanque de nitrógeno líquido de 8 litros Marca IMV
►►Cooler de espuma de 12 litros
►►Rack para pajillas de 0.5 cc
►►Balones volumétricos
►►Vasos de precipitación
►►Agitador magnético Marca Cryo
►►Luces UV
Se utilizó el semen de un reproductor de raza Jersey de 3 años, al cual se realizaron 6
extracciones utilizando una vagina articial y de cada extracción se procesaron pajillas de 0.5
cc con una concentración espermática de 50 millones de espermatozoides por dosis. Del total
de pajillas congeladas se seleccionaron al azar 10 pajillas por extracción para realizar el proceso
de recongelación.
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ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
Para el procesamiento y congelación de semen se utilizó el protocolo usado en el
Laboratorio de Reproducción Animal de la ESPOCH.
Análisis macroscópico del semen: Este análisis consiste en evaluar características
macroscópicas del semen como: Color, olor y pH. La medición de color y olor se la realiza con
la subjetividad y experiencia del investigador, mientras que el pH se evaluó con un pH metro
digital.
Análisis microscópico: Fue realizado en semen fresco, semen descongelado producto
de la congelación y semen descongelado producto de la recongelación como se describe a
continuación.
Evaluación de motilidad individual (%): Con una micropipeta se tomó una microgota (5 µL)
de semen diluido en una solución isotónica de NaCl- al 0,9% misma que fue colocada sobre un
portaobjetos atemperado a 37ºC y cubriéndolo con un cubreobjetos; la observación se la realizó
en un microscopio óptico con un aumento de 40X, para la estimación se evaluó si más de la
mitad de los espermatozoides que hay en el campo poseen movimiento o no, se observaron los
espermatozoides que se mueven en forma rectilínea, a los cuales se los considera normales,
caso contrario, los que se mueven en círculo se consideraron anormales. El porcentaje se
obtuvo de los espermatozoides con movimiento rectilíneo progresivo (normales) sobre el total
de los espermatozoides observados en la placa, valores a ser comparados con la siguiente
escala de 0 a 100% como se observa en la Tabla 1.
Tabla 1
Valoración de la Motilidad Individual Progresiva según la
Sociedad Americana de Theriogenología.
Clasicación Motilidad progresiva individual Valor %
Pobre Muy lento y errático <50
Aceptable Lineal lento y generalizado 60-70
Bueno Lineal moderadamente rápido 70-80
Muy bueno Lineal rápido 80-100
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
Evaluación de Viabilidad espermática (%): Para determinar la viabilidad espermática se usó
la técnica con tinción de Eosina–Nigrosina, misma que consiste en agregar 10 µL del colorante
sobre 10 µL de la muestra de semen en un portaobjetos atemperado a 37°C, después de
homogenizarla se la dejó reposar un minuto y se realizó un frotis para nalmente se dejarla
secar. La muestra se observó en un microscopio óptico a un aumento de 100X, contando un
mínimo de 100 espermatozoides en diferentes campos del portaobjetos.
Los espermatozoides con cabeza roja o rosa oscuro son considerados muertos (membrana
dañada), mientras espermatozoides con cabeza blanca o rosa claro son considerados vivos
(membrana intacta).
El resultado se determinó de forma subjetiva y se calculó mediante la siguiente relación:
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Evaluación de Morfoanomalías espermáticas (%): Se utilizó la misma placa de análisis de
viabilidad espermática en donde se observó la estructura de los espermatozoides con un
aumento de 100X. Las células sin anomalías mismas que serán clasicadas como normales
presentaron la cabeza y agelo regulares, y las células anormales presentan alguna de las
siguientes categorías de morfoanomalías: cabezas muy grandes, cabezas muy pequeñas,
doble cabeza, agelos doblados, agelos enrollados, agelos múltiples o sin agelo, presencia
de gota citoplasmática proximal o distal. Se contaron un total de 100 espermatozoides por
campo y se utilizó la siguiente fórmula para transformarlo a porcentaje:
Análisis del daño del paquete de ADN del espermatozoide (Cromatina) (%): Se evaluó mediante la
integridad de la cromatina, para esto se preparó una muestra de 2 µL del uorocromo Naranja de
Acridina y 18 µL de semen descongelado; a continuación, se procedió a homogenizar la muestra
para tomar con una micropipeta la cantidad de 10 µL y colocarlos en la placa del contador digital de
células Luna Fl, el cual se encontraba calibrado y en modo de uorescencia con naranja de acridina.
Las cabezas de los espermatozoides con ADN en estado nativo (intacto) emiten uorescencia verde,
mientras que aquellos, cuyo ADN se encuentra desnaturalizado se observan de color rojizo. Los
resultados de este análisis fueron emitidos en porcentaje por el equipo mencionado.
Evaluación de la integridad de la membrana celular (%): Para la valoración de esta variable se utilizó
el test Hipoosmótico (HOST), el cual consiste en preparar una solución de fructosa al 2.7% (solución
A) y una solución de Citrato de sodio 1.47% (solución B). El medio hipoosmótico se preparó en el
momento de utilizarlo mezclando 0.5 ml de solución A con 0.5 ml de solución B, al que se agregó
0.1 ml de semen descongelado. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a 37 °C. Finalmente se
colocó 10 µL de la mezcla incubada entre porta y cubreobjetos, y se observó en microscopio con un
aumento de 100X, se contaron como mínimo 100 espermatozoides y se determinó el número de
espermatozoides con membrana funcional (colas y/o segmento intercalar hinchados y enrollados),
y el número de espermatozoides con membrana deteriorada (cola y/o segmento intercalar recto,
delgado y sin enrollamiento). Los resultados se expresaron en porcentaje de reacción total de
espermatozoides con membrana funcional utilizando la siguiente fórmula:
En donde:
Int. Memb.= Integridad de membrana (por ciento).
A = Número de espermatozoides con endósmosis positiva.
B = Número de espermatozoides con endósmosis negativa.
A + B = N° total de espermatozoides contabilizados (100 espermatozoides).
Dilución, envasado y sellado de pajillas: Para la dilución del semen fresco y descongelado se
utilizó el diluyente comercial AndroMed®, la concentración espermática se determinó con la
ayuda del contador digital de células Luna Fl y se diluyó el semen bajo las especicaciones del
fabricante. Las dosis a congelarse y recongelarse fueron envasadas en pajillas de 0.5 cc con una
concentración de 60 millones de esepermatozoides para la congelación y con 30 millones de
espermatozoides para la recongelación. Finalmente se sellaron con alcohol polivinilo.
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ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
Estabilización y acondicionamiento de los espermatozoides: La estabilización y
acondicionamiento de los espermatozoides consiste en darle a la célula el tiempo y condiciones
necesarias para que ésta saque toda el agua intracelular y la reemplace por el diluyente, con la
nalidad de que al momento de la congelación, recongelación y descongelación no se formen
cristales de hielo los cuales perforarían la membrana celular dañando así al espermatozoide.
Para esto se mantuvieron las pajillas a temperatura ambiente (14 – 20 oC) y bajo luz ultravioleta
durante un tiempo de 45 minutos.
Curvas de temperatura: Tanto para la congelación como para la recongelación se utilizaron
las mismas curvas, las cuales tuvieron como nalidad el descenso controlado y paulatino
de la temperatura para que la célula espermática no sufra daño debido a cambios térmicos
bruscos, dichas curvas iniciaron reduciendo la temperatura de 20 °C a 5 °C en 30 minutos
(velocidad: -0.5 °C/min) mediante la adición de hielo en un cooler con agua. Una vez alcanzada
esta temperatura se introdujeron las pajillas en una cámara de refrigeración por un lapso de 4
horas a una temperatura de 4 °C para el periodo de equilibramiento.
Congelación y Recongelación: La congelación y recongelación se realizó mediante vapores de
nitrógeno colocando las pajillas en un rack con capacidad de 50 pajillas dentro de un cooler en el
cual se colocaron 2 cm de nitrógeno líquido. El descenso de temperatura se realizó en relación
con los siguientes valores y tiempos: primer descenso de 4 °C a -6 °C durante 10 minutos
(velocidad -1 °C/min), esto se logró colocando el rack a 6 cm del nitrógeno líquido. Segundo
descenso de -6 °C a -196 °C en 4 minutos (velocidad -47.50 °C/min), esto se logró colocando
el rack a 2 cm del nitrógeno líquido. Realizado este descenso se sumergieron las pajillas en el
nitrógeno líquido del cooler para terminar con su congelación y recongelación.
La metodología utilizada para la recongelación fue la siguiente:
Descongelación e incubación de semen: La descongelación se realizó en agua a 56 °C durante 12
segundos, proceso que simula una agresión seminal máxima. El contenido de cada una de las
pajillas se vertió y mantuvo en tubos de ensayo atemperados en baño termostático a 37 °C y se
incubaron durante 15 minutos, conteniendo cada uno de ellos 5 ml de medio Tyrode (Tabla 2).
Tabla 2: Composición del medio Tyrode.
Compuesto Concentración (g/l)
NaCl 8.00
KCl 0.20
CaCl20.20
MgCl20.10
NaH2PO40.05
NaHCO31.00
Glucosa 1.00
Fuente: Rigby et al (2001, págs. 171-180)
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021
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Centrifugación: Con la nalidad de seleccionar a los espermatozoides viables se utilizó la
técnica de selección por gradiente de concentración, la cual consistió en incubar las muestras
descongeladas en medio Tyrode durante 15 minutos para realizar la primera centrifugación (300
rpm, durante 5 minutos) eliminándose el pellet y conservando el sobrenadante; a continuación,
se realizó una segunda centrifugación (800 rpm, durante 10 minutos), rescatando el pellet y
eliminando el sobrante en este caso. Con esto se logró que los espermatozoides viables
precipiten y sean los seleccionados para la recongelación.
Una vez realizada la selección de espermatozoides viables, éstos fueron colocados en
un tubo graduado para determinar su volumen y con la ayuda del contador digital de células
Luna Fl se contabilizó la concentración espermática. La dilución, envasado y sellado de pajillas,
estabilización y acondicionamiento de espermatozoides y curvas de temperatura se manejaron
igual tanto en la congelación como en la recongelación.
Comprobación de hipótesis: La comprobación de hipótesis se realizó en el software estadístico
InfoStat versión 2020 en donde se utilizaron las técnicas de análisis de varianza (ADEVA)
y separación de medidas por el método del rango múltiple de Waller Duncan a un nivel de
signicancia p<0,01.
Resultados y discusión
Análisis comparativo de las características microscópicas de semen bovino en los procesos
post congelación y post recongelación.
Al realizar el análisis estadístico mediante el Software Infostat versión 2020 y separación
de medias por el método de Waller Duncan de las características microscópicas de semen se
registraron diferencias altamente signicativas (P≥0,01), para todas las variables en estudio
como se observa en la Tabla 3.
Tabla 3
Resultados comparativos de las características microscópicas de semen bovino en los
procesos pre congelación, post congelación y post recongelación.
Variables E1 E2 E3 EE Prob.
Ph 6,83 b 6,78 c 6,85 a 1,1171e-16 0,001
Motilida individual, % 80,0000 a 53,5000 b 46,1660 c 0,486374494 0,001
Viabilidad espermática,
%97,033 b89,499 a 81,016 c 0,157632249 0,001
Morfología normal, % 95,085 b95,031 b97,00 a0,134042973 0,001
Morfoanomalías, % 4,915 b4,969 b1,899 a 0,133436488 0,001
Normalidad en adn, % 0 c 91,26 b98,43 a0,522102019 0,001
Daño en el adn, % 0 c 8,74 b 1,072 a 0,513588537 0,001
Integridad de la
membrana, % 0 c 90,868 b98,15 a 0,238478278 0,001
Daño en la membrana,
%0 c 9,132 b 1,602 a 0,238472919 0,001
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RECONGELACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
E1: Ensayo 1 – análisis microscópico de semen pre congelación.
E2: Ensayo 2 – análisis microscópico de semen post congelación.
E3: Ensayo 3 – análisis microscópico de semen post recongelación.
EE: Error experimental.
Prob: Probabilidad.
Letras diferentes muestran diferencias signicativas para cada variable.
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
pH: El pH del eyaculado en los diferentes ensayos mostró diferencias estadísticas signicativas
(P≥0,01), con valores de 6,78; y 6,85 puntos de pH en el semen congelado y recongelado
respetivamente (Tabla 3), valores que se encuentran dentro de los parámetros permitidos
según (Huamantuco, 2005), quien menciona que el pH del epidídimo y conducto deferente
uctúa entre 6,72 a 6,90.
Motilidad individual (%): La motilidad individual presentó diferencias estadísticas
signicativas (P≥0,01), con valores de 53,50 % y 41,16 % para el semen congelado y recongelado
respectivamente (Tabla 3). En relación con estos valores, Peres et al. (2014) indican que la
reducción de la motilidad espermática puede estar asociada a la lesión mitocondrial, pues es
necesaria energía tanto para la motilidad como para la fertilización. Por su parte, Ramónez
(2013), en su investigación reporta un valor de 35,98% en la variable de motilidad individual
progresiva con un valor máximo del 55%; mientras que, Ribeiro- Peres et al. (2014, págs. 20-
25), en relación con esta variable reporta un resultado de 29,5 % +/- 14,9 % en su estudio,
realizando una congelación convencional. Estos resultados dieren de la presente investigación
presumiblemente debido a la subjetividad del evaluador al momento del análisis y a los métodos
de congelación y descongelación del material seminal.
La diferencia encontrada en los diferentes ensayos puede estar relacionada, además, al
estrés que sufre la membrana y el espermatozoide en general por el cambio de temperatura,
las lesiones producidas por el congelamiento de las membranas solo se invierten parcialmente
con el descongelamiento. La motilidad post congelación se reduce a valores entre 40 a 50%.
Viabilidad espermática (%): Con relación a la viabilidad espermática en los ensayos se
presentaron diferencias signicativas (P<0,01), de esta manera el mayor porcentaje de viabilidad
fue identicado en el semen congelado con 89,49 % y el menor valor se registró en el semen
recongelado con 81,01 % (Tabla 3) (Figura 1).
Al respecto, Cabrera y Pantoja (2012) encontraron una viabilidad del 86 % en semen
descongelado, resultados que dieren a los reportados por Ribeiro Peres et.al. (2014, págs. 20-
25), quienes mencionan un 53,9 % de viabilidad espermática en semen descongelado. Dichos
resultados varían debido al criterio del evaluador, así como al método utilizado, se podría
estandarizar el método al realizar un análisis mediante un sistema automatizado como es
el caso del sistema CASA pero tanto en la presente investigación como en las mencionadas
anteriormente el análisis se lo realizó de la forma convencional.
Almela (2014) menciona un 60,21% de viabilidad espermática en el descongelamiento
de semen recongelado, lo que puede ser ocasionado por parámetros como la raza, edad
del reproductor y principalmente el método de descongelación usado para su investigación;
mientras que Mejía (2017) menciona un 59,1 % +/- 2,40 de vitalidad espermática en semen
descongelado y Carpio (2015), reporta un 82,50 % de viabilidad espermática al realizar el análisis
de semen descongelado, resultado muy similar al presente estudio.
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Cómo citar este artículo:
Mancheno, A,. Duchi, N,. Andino. P. & Villafuerte, A. (Julio - diciembre de 2022). Recongelación de espermatozoides bovinos como alternativa para mejorar
la calidad espermática del semen. Sathiri (17),2 103-117. https://doi.org/10.32645/13906925.1133
Las diferencias encontradas entre los ensayos se pueden deber a lo indicado por Neira
et al., (2007, págs. 93-105), quienes señalan que la centrifugación ejercida durante los procesos
puede generar diversas alteraciones que pueden disminuir la movilidad de los espermatozoides
e incluso su calidad en general, debido a las fuerzas mecánicas asociadas.
Figura 1: Diferencia en la viabilidad espermática de semen bovino pre congelado (E1), post congelado
(E2) y post recongelado (E3).
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
Morfoanomalías (%): Las morfoanomalías observadas presentaron diferencias estadísticas
signicativas (P≥0,01) entre los ensayos, en donde el mayor valor se reportó en el semen
congelado con 4,96 % de morfoanomalías mientras que el menor valor lo registró en el semen
recongelado con 1,89 % de morfoanomalías (Tabla 3) (Figura 2). Los valores en la recongelación
probablemente están atribuidos a lo señalado por Palma (2009), quien detalla que un menor
daño en la célula espermática es consecuencia de haber tenido un menor sufrimiento durante
el proceso de recongelación, aumentando consecuentemente la presencia de espermatozoides
normales. Además, se puede mencionar que al momento de realizar la recongelación se realizó
una selección de los mejores espermatozoides para usarlos en este proceso. En función los
valores registrados, Vera (2003) menciona que es de gran importancia garantizaran el mayor
porcentaje de morfología normal dentro de los espermatozoides, ya que esto optimizará una
buena fusión con el núcleo del ovocito para nalmente completar la dotación genética del
nuevo ser.
Gonzáles & Muñóz (2002), registran anormalidades primarias en la raza Jersey de
15,2 % +/- 1,8; valores que son superiores a los obtenidos en la presente investigación, esto
posiblemente se deba a la manera en la que fue descongelado el semen y sobre todo a la
preparación de la muestra.
Mejía (2017), en su estudio realizado al evaluar el semen de ganado criollo utilizando vagina
articial y la técnica de microscopía óptica, reporta un promedio de anormalidades totales de
15,0 +/- 0,96 lo que diere del presente estudio probablemente por la subjetividad en el análisis,
raza de los animales y condiciones de congelación y descongelación; mientras que Ramónez
(2013), en el análisis de semen post congelación reporta un 13,15 % de espermatozoides con
morfoanomalías. Muchas veces dicho resultado varía por la forma en la preparación de la placa
lo que puede confundir al evaluador en anormalidades que se presenten principalmente a
nivel de la parte distal de la célula espermática.
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la calidad espermática del semen. Sathiri (17),2 103-117. https://doi.org/10.32645/13906925.1133
RECONGELACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
Figura 2: Diferencia en las morfoanomalías de semen bovino pre congelado, post congelado y post recongelado.
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
Daño del ADN (%): Al analizar el daño en el ADN mediante el proceso de uorescencia con
Naranja de Acridina los ensayos presentaron diferencias signicativas (P<0,01), de esta manera
el mayor daño del ADN se observó en el semen congelado con un valor 8,74 %, y el menor
daño lo reportó el semen recongelado con un valor de 1,07 % (Tabla 3) (Figura 3). Los valores
reportados en la presente investigación son menores a los registrados por Almela (2014),
en donde en el semen recongelado reportó el valor de 32,7 % en daño del ADN de semen
recongelado.
Al respecto, Nava-Trujillo et al. (2016) reportan un 0,9 % +/- 1.29 de espermatozoides
con cromatina dañada al evaluar semen post congelación, resultados muy similares a los
presentados en el presente estudio. Por otra parte, Ribeiro Peres et al., (2014), encontraron
un 93,1 +/- 6,1 % de ADN íntegro en semen descongelado, lo que representa a un 6,9 % de
daño en la cromatina. Dichos resultados concuerdan con la presente investigación debido a
las técnicas usadas y a que el análisis se realizó utilizando un equipo automatizado en todos
los casos.
Peña y Linde (2000) al respecto, mencionan que el acrosoma tiene varias regiones que
son expuestas durante el proceso de refrigeración, congelación y descongelamiento; esto
determinará en gran medida la capacidad fecundante que tiene el espermatozoide debido al
daño que puede sufrir especícamente la cromatina.
Los resultados del presente estudio son los primeros en sugerir un efecto favorable al
usar la recongelación de espermatozoides reducir el daño del ADN espermático contenido en
la cromatina.
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la calidad espermática del semen. Sathiri (17),2 103-117. https://doi.org/10.32645/13906925.1133
Figura 3: Diferencias en el daño del ADN de semen de bovino Jersey pre congelado, post congelado y post recongelado.
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
Daño en la membrana (%): En relación a la variable daño de la membrana se observaron
diferencias altamente signicativas (P<0,01) entre los ensayos; el valor más alto se observó en
el semen congelado con 9,13 % y el menor valor lo reportó el semen recongelado con 1,60 %
de daño en la membrana (Tabla 3) (Figura 4).
Bedoya, Vásquez & Rivera (2003), en su estudio reportan un 53,4 % de espermatozoides
que reaccionaron de forma positiva al test de HOST, lo que representa un 46,6 % de
espermatozoides con daño en la membrana; mientras que Ribeiro Peres et al., (2014), mencionan
un 63,1 % de espermatozoides con la membrana íntegra, es decir 36,9 % de espermatozoides
con daño en la membrana. Estos resultados dieren del presente estudio y se puede asumir
esta variación al método de análisis, así como a la subjetividad del evaluador al hacerla de una
manera tradicional y no automatizada.
Mejía (2017), en relación con esta variable, reporta un 15,6 % de espermatozoides que
reaccionaron con daño a la membrana espermática al ser analizados mediante el test de Host.
Dichos resultados varían de los obtenidos al presente estudio, se puede asumir esta variación
al método de incubación utilizado, así como a la preparación del medio de incubación usado
en el test.
La membrana plasmática del espermatozoide es el principal sitio de lesión que ocurren
durante la congelación y descongelación de semen (Hammersestedt, Graham, & Nolan,
1990, págs. 73-88). La membrana intacta y un funcionamiento activo es esencial para que
el espermatozoide pueda mantener el metabolismo, someterse a la capacitación y reacción
acrosómica y, además, para unir y penetrar en el ovocito a través de la zona pelúcida (Jeyendran,
Van de Ven, Perez Pelaez, Crabo, & Zaneveld, 1984, págs. 219-228).
Al comparar los resultados obtenidos en este trabajo, con los de otros autores como
(Muhammad, Rakha, & Akhter, 2010, págs. 197-203), los cual usaron L-cisteína y obtuvieron un
56.06 % de membranas intactas, los resultados en esta investigación son superiores en cuanto
a membranas intactas, lo que posiblemente se deba a la diferencia en la composición de los
diluyentes y a los diferentes protocolos de criopreservación en cuanto se reere al tiempo en
la etapa de enfriamiento, mismo que afecta directamente las características de funcionalidad
celular del espermatozoide al permanecer mayor tiempo en contacto con los solutos del
diluyente.
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RECONGELACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES BOVINOS
COMO ALTERNATIVA PARA
MEJORAR LA CALIDAD
ESPERMÁTICA DEL SEMEN
Ante estos resultados, se puede inferir que la recongelación de espermatozoides permite
mantener la integridad de la membrana, por su parte González & Muñoz (2002), indican que
la membrana plasmática del esperma juega un papel crítico en el proceso de capacitación,
reacción acrosómica y penetración de ovocitos, al regular las interacciones del medio interno
con el externo.
Figura 4: Diferencias en el daño de la membrana de semen de bovino Jersey pre congelado, post congelado y post recongelado.
Realizado por: Mancheno Herrera, Carlos Andrés, 2021.
Conclusiones
►►Al analizar las diferentes variables de semen recongelado se determinó que el
efecto de esta biotecnología es positivo en variables como el daño en el ADN y daño
en la membrana espermática, teniendo valores inferiores a los reportados en semen
congelado; lo que indica que al recongelar espermatozoides la calidad espermática
mejora especialmente en las variables mencionadas.
►►El porcentaje de espermatozoides viables de semen congelado fue de 89.48 % mientras
que esta variable para semen recongelado reportó un valor de 81.01 % aduciendo esta
variación al estrés de temperatura que sufren los espermatozoides por el proceso de
descongelación y recongelación. Sin embargo, los valores se encuentran dentro de los
rangos recomendados para ser usados en biotecnologías como la inseminación articial,
transferencia de embriones y fertilización in vitro.
►►Los resultados al evaluar el daño de la membrana plasmática de los espermatozoides
reportaron valores de 9.13% en semen descongelado mientras que el semen recongelado
reportó un valor de 1.62% lo que claramente reeja un incremento en la integridad de la
membrana plasmática al recongelar los espermatozoides.
►►El daño en el paquete de ADN de los espermatozoides se vió reducido al recongelarlos
obteniendo un 1.07 % de daño en semen recongelado versus 8.74 % de daño en
semen congelado. Estos datos hacen una primera inferencia en que la recongelación
de espermatozoides seleccionará a las mejores células para tener una mejor eciencia
al momento de utilizarlas en biotecnologías reproductivas, haciendo una referencia
especial a su uso en fertilización in vitro FIV.
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